INTRODUCCION

Todas las reacciones químicas son fundamentalmente de naturaleza eléctrica, puesto que hay electrones involucrados en todos los tipos de enlaces químicos. Sin embargo, la electroquímica es primordialmente el estudio del fenómeno de oxido-reducción.

Las relaciones entre cambios químicos y energía eléctrica tienen importancia teórica y practica. Las relaciones químicas pueden utilizarse para producir energía eléctrica (en pilas que se llaman pilas voltaicas o galvánicas). La energía eléctrica puede utilizarse para realizar transformaciones químicas (en pilas electrolíticas). Además el estudio de los procesos electroquímicos lleva a la comprensión y a la sistematización de los fenómenos de oxido-reducción que ocurren fuera de las pilas.

Corriente eléctrica y movimiento de iones

Célula voltaica

Una célula voltaica aprovecha la electricidad de una reacción química espontánea para encender una bombilla (foco). Las tiras de cinc y cobre, dentro de disoluciones de ácido sulfúrico diluido y sulfato de cobre respectivamente, actúan como electrodos. El puente salino (en este caso cloruro de potasio) permite a los electrones fluir entre las cubetas sin que se mezclen las disoluciones. Cuando el circuito entre los dos sistemas se completa (como se muestra a la derecha), la reacción genera una corriente eléctrica. Obsérvese que el metal de la tira de cinc se consume (oxidación) y la tira desaparece. La tira de cobre crece al reaccionar los electrones con la disolución de sulfato de cobre para producir metal adicional (reducción). Si se sustituye la bombilla por una batería la reacción se invertirá, creando una célula electrolítica.

La mayoría de los compuestos inorgánicos y algunos de los orgánicos se ionizan al fundirse o cuando se disuelven en agua u otros líquidos; es decir, sus moléculas se disocian en componentes cargados positiva y negativamente que tienen la propiedad de conducir la corriente eléctrica. Si se coloca un par de electrodos en una disolución de un electrólito (o compuesto ionizable) y se conecta una fuente de corriente continua entre ellos, los iones positivos de la disolución se mueven hacia el electrodo negativo y los iones negativos hacia el positivo. Al llegar a los electrodos, los iones pueden ganar o perder electrones y transformarse en átomos neutros o moléculas; la naturaleza de las reacciones del electrodo depende de la diferencia de potencial o voltaje aplicado.

La acción de una corriente sobre un electrólito puede entenderse con un ejemplo sencillo. Si el sulfato de cobre se disuelve en agua, se disocia en iones cobre positivos e iones sulfato negativos. Al aplicar una diferencia de potencial a los electrodos, los iones cobre se mueven hacia el electrodo negativo, se descargan, y se depositan en el electrodo como elemento cobre. Los iones sulfato, al descargarse en el electrodo positivo, son inestables y combinan con el agua de la disolución formando ácido sulfúrico y oxígeno. Esta descomposición producida por una corriente eléctrica se llama electrólisis.

En todos los casos, la cantidad de material que se deposita en cada electrodo al pasar la corriente por un electrólito sigue la ley descubierta por el químico físico británico Michael Faraday. Esta ley afirma que la cantidad de material depositada en cada electrodo es proporcional a la intensidad de la corriente que atraviesa el electrólito, y que la masa de los elementos transformados es proporcional a las masas equivalentes de los elementos, es decir, a sus masas atómicas divididas por sus valencias.

Todos los cambios químicos implican una reagrupación o reajuste de los electrones en las sustancias que reaccionan; por eso puede decirse que dichos cambios son de carácter eléctrico. Para producir una corriente eléctrica a partir de una reacción química, es necesario tener un oxidante, es decir, una sustancia que gane electrones fácilmente, y un reductor, es decir, una sustancia que pierda electrones fácilmente. Las reacciones de este tipo pueden entenderse con un ejemplo, el funcionamiento de un tipo sencillo de pila (batería) electroquímica. Al colocar una varilla de cinc en una disolución diluida de ácido sulfúrico, el cinc, que es un reductor, se oxida fácilmente, pierde electrones y los iones cinc positivos se liberan en la disolución, mientras que los electrones libres se quedan en la varilla de cinc. Si se conecta la varilla por medio de un conductor a un electrodo de metal inerte colocado en la disolución de ácido sulfúrico, los electrones que están en este circuito fluirán hacia la disolución,donde serán atrapados por los iones hidrógeno positivos del ácido diluido. La combinación de iones y electrones produce gas hidrógeno, que aparece como burbujas en la superficie del electrodo. La reacción de la varilla de cinc y el ácido sulfúrico produce así una corriente en el circuito externo. Una pila electroquímica de este tipo se conoce como pila primaria o pila voltaica.

En la batería de acumuladores, o acumulador (conocida comúnmente como pila secundaria), se proporciona energía eléctrica desde una fuente exterior, que se almacena en forma de energía química. La reacción química de una pila secundaria es reversible, es decir, se produce en un sentido cuando se carga la pila, y en sentido opuesto cuando se descarga. Por ello, una pila secundaria puede descargarse una y otra vez.

APLICACIONES INDUSTRIALES

La descomposición electrolítica es la base de un gran número de procesos de extracción y fabricación muy importantes en la industria moderna. La sosa cáustica (un producto químico importante para la fabricación de papel, rayón y película fotográfica) se produce por la electrólisis de una disolución de sal común en agua. La reacción produce cloro y sodio. El sodio reacciona a su vez con el agua de la pila electrolítica produciendo sosa cáustica. El cloro obtenido se utiliza en la fabricación de pasta de madera y papel.

Una aplicación industrial importante de la electrólisis es el horno eléctrico, que se utiliza para fabricar aluminio, magnesio y sodio. En este horno,se calienta una carga de sales metálicas hasta que se funde y se ioniza. A continuación, se deposita el metal electrolíticamente.

Los métodos electrolíticos se utilizan también para refinar el plomo, el estaño, el cobre, el oro y la plata. La ventaja de extraer o refinar metales por procesos electrolíticos es que el metal depositado es de gran pureza. La galvanotécnia, otra aplicación industrial electrolítica, se usa para depositar películas de metales preciosos en metales base. También se utiliza para depositar metales y aleaciones en piezas metálicas que precisen un recubrimiento resistente y duradero. La electroquímica ha avanzado recientemente desarrollando nuevas técnicas para colocar capas de material sobre los electrodos, aumentando así su eficacia y resistencia. Tras el descubrimiento de ciertos polímeros que conducen la electricidad, es posible fabricar electrodos de polímeros.

CONDUCCION METALICA

Una corriente eléctrica es el flujo de la carga eléctrica. En los metales esta carga es llevada por los electrones y la conducción eléctrica de este tipo se llama conducción metálica. La corriente resulta de la aplicación de una fuerza eléctrica suministrada por una pila, batería, o alguna otra fuente de energía eléctrica. Se necesita un circuito completo para producir una corriente.

Los cristales metálicos pueden describirse en los términos de nubes de electrones en movimiento atravesando las redes relativamente fijas de los iones metálicos positivos. Cuando los electrones se dirigen hacia una terminal del alambre metálico, los electrones en movimiento desplazan otros electrones de la nube en el punto de entrada. Los electrones desplazados, a su vez, adquieren nuevas posiciones empujando los electrones vecinos hacia delante y este efecto se trasmite por el alambre hasta que los electrones son forzados fuera del alambre en el extremo opuesto. La fuente de energía puede ser considerada un bomba de electrones, pues sirve para forzar a los electrones por uno de los terminales de circuito y sacarlos por el otro extremo. En cualquier posición en el alambre, se conserva la neutralidad eléctrica, pues la velocidad de entrada de los electrones iguala la velocidad de salida de los mismos. Hace mucho se conoce la analogía entre el flujo de la electricidad fue descrita en términos de una corriente de ” fluido eléctrico“. Convencionalmente, desde hace tiempo (en los tiempos de Benjamin Franklin, 1747), antes de que se identificara el electrón, se adscribe una carga positiva a esta corriente. Interpretaremos los circuitos eléctricos en términos del movimiento del electrón. Sin embargo, debemos recordar que la corriente eléctrica convencional es descrita arbitrariamente como positiva y fluye en dirección opuesta.

La corriente eléctrica se mide en amperes (A). LA cantidad de carga eléctrica se mide en coulombs (C); el coulombs se define como la cantidad de electricidad transmitida en un segundo mediante una corriente de un ampere. Por consiguiente:

1 A = 1 C/s y 1 C = 1 A.s

La corriente eléctrica se hace pasar a través del circuito mediante una diferencia de potencial eléctrico, el cual se mide en volts (V). Se necesita un joule de trabajo para mover un coulomb desde un potencial mas bajo a uno mas alto cuando la diferencia de potencial es de un volt. Un volt, por consiguiente,es igual a un joule coulomb y un volt coulomb es una unidad de energía e igual a un joule.

1 V = 1 J/C

1 V . C = 1 J

Mientras mayor sea la diferencia de potencial entre dos puntos en un alambre dado, mayor será la corriente que transporte el alambre entre estos dos puntos. Georg Simon Ohm, en 1826, expreso la relación cuantitativa entre la diferencia de potencial, E, en voltios y la corriente, I, en amperes, como:

I = E/ R o E = I . R

donde la constante de proporcionalidad, R, de la ley de Ohm se llama la resistencia. La resistencia se mide en ohms (Ω). Se requiere un volt para transportar una corriente de un ampere a través de una resistencia de un ohm.

La resistencia para el flujo de electricidad en los metales es originada probablemente por la vibración de los iones metálicos en sus posiciones del cristal. Estas vibraciones interfieren con el movimiento de los electrones y retardan la corriente. A medida que aumenta la temperatura, aumenta el movimiento térmico de los iones metálicos. Por lo tanto, la resistencia de los metales aumenta y se convierten en conductores deficientes.

CONDUCCION ELECTROLITICA

La conducción electrolítica,en la cual la carga es transportada por los iones, no ocurrirá a menos que los iones del electrólito se puedan mover libremente. Por consiguiente, la conducción electrolítica es exhibida principalmente por sales fundidas y por soluciones acuosas de electrólitos. Por consiguiente, una corriente que pase a través de un conductor electrolítico requiere que el cambio químico acompañe el movimiento de los iones.

Estos principios de conducción electrolítica se ilustran mejor refiriéndonos a una pila electrolítica tal como la representa la figura “1″, para la electrólisis del NaCl fundido entre electrodos inertes (los electrodos inertes no participan en reacciones de electrodos). La fuente de corriente envía electrones hacia el electrodo izquierdo, el cual por lo tanto puede considerarse cargado negativamente. Los electrones salen del electrodo de la derecha, el electrodo positivo. En el campo eléctrico así producido,los iones de sodio (catiónes) son atraídos hacia el polo positivo (ánodo). La carga eléctrica en la conducción electrolítica es transportada por los cationes que se mueven hacia el cátodo y los aniones que se mueven en dirección opuesta hacia el ánodo.

Figura “1″ Electrólisis del cloruro de sodio fundido

Para un circuito completo la reacción del electrodo debe acompañar el movimiento de los iones. En el cátodo algunas especies químicas (no necesariamente el transportador de carga) debe aceptar electrones y debe reducirse. En el ánodo, los electrones deben ser separados de algunas especies químicas que, como consecuencia, se oxidan. La s convenciones relativas a los términos ánodo y cátodo se resumen el la tabla “A”.

En la pila del diagrama, los iones sodio se reducen en el cátodo:

Na⁺ + e ^{- ®} Na

y los iones cloruro se oxidan en el ánodo.

2 Cl^{- ®} Cl₂ + 2 e ^-

La suma adecuada de estas dos ecuaciones parciales de la reacción para toda la pila es:

2 NaCl _(L) ^{electrólisis}- ® 2Na _(L) + Cl_{2 (G)}

En la operación real de una pila comercial utilizada para producir sodio metálico, se agrega cloruro de calcio para hacer descender el punto de fusión del cloruro de sodio y la pila se opera a una temperatura aproximada de 600 °C. A esta temperatura, el sodio metálico es un liquido.

Podemos trazar el flujo de la carga negativa a través del circuito de la figura “1″ como sigue: los electrones dejan la fuente de corriente y son enviados al cátodo donde son recogidos y reducidos los iones sodio que han sido atraídos a este electrodo negativo. Los iones cloruro se mueven del cátodo hacia el ánodo y así transportan carga negativa en esta dirección. En el ánodo, los electrones son removidos de los iones cloruro, oxidándolos a cloro gaseoso. Estos electrones son sacados de la pila por la fuente de corriente. En esta forma, se completa el circuito.

La conducción electrolítica se basa entonces sobre la movilidad de los iones y cualquier cosa que inhiba el movimiento de estos origina una resistencia a la corriente.

Los factores que influyen en la conductividad eléctrica de las soluciones de electrolitos incluyen atracciones interiónicas, solvatación de iones y viscosidad del disolvente. Estos factores se fundamentan sobre atracciones soluto-soluto y soluto-disolvente e interacciones disolvente-disolvente, respectivamente. El promedio de energía cinética de los iones soluto aumenta a medida que se eleva la temperatura y, por consiguiente, la resistencia de los conductores electroliticos disminuye por lo general a medida que se aumenta la temperatura.

En todo momento, la solución es eléctricamente neutra. La carga total positiva de todos los cationes iguala la carga total negativa de todos los aniones.

ELECTROLISIS

La electrólisis del cloruro de sodio fundido sirve como fuente comercial de sodio metálico y cloro gaseoso. Procedimientos similares se usan para preparar otros metales muy activos (tales como potasio y calcio). Cuando se electrolizan ciertas soluciones acuosas, el agua esta involucrada en las reacciones de los electrodos en vez de los iones derivados del soluto; por lo tanto, los iones transportadores de corriente no se descargan necesariamente en los electrodos.

En la electrólisis del sulfato de sodio acuoso, los iones sodio se desplazan hacia el cátodo y los iones sulfato se mueve hacia el ánodo (figura “2″). Ambos iones se descargan difícilmente; cuando esta electrólisis se lleva a cabo entre los electrodos inertes, se desprende hidrogeno gaseoso en el cátodo y la solución que rodea el electrodo se hace alcalina.

2 e^- + 2 H₂O ® H_2(G) + 2 OH^- 2 H₂O ® O_2(G) + 4 H⁺ + 4 e^-

La reducción ocurre en el cátodo pero en vez de la reducción del ion sodio.

e⁺ + Na^{+ ®} Na

el cambio neto que ocurre es la reducción del agua.

2 e^- + 2 H₂O ® H_2(G) + 2 OH^-

El agua es un electrolito demasiado débil. El agua pura se ioniza aproximadamente 2 _x 10^-7 % a 25 °C.

2 H₂O « H₃O⁺ + OH^-

o, mas brevemente,

H₂O « H⁺ + OH^-

No se conoce el mecanismo exacto de la reacción en el cátodo de la electrólisis del Na₂SO₄ acuoso. Puede ser que los iones de hidrógeno del agua se descargan y que la reacción procede como sigue:

H₂O « H⁺ + OH^-

2 e^- + 2 H⁺ ® H_2(G)

La multiplicación de la primera ecuación por 2 seguida por la adición de las dos ecuaciones da el cambio sigue:

2 e^- + 2 H₂O ® H_2(G) + 2 OH^-

En general, el agua se reduce en el cátodo (produciendo hidrógeno gaseoso e iones hidróxido) a pesar de que el catión del soluto es difícil de reducir.

La oxidación ocurre en el ánodo y en la electrólisis del Na₂SO₄ acuoso, los aniones (SO₄⁼) que emigran hacia el ánodo son difíciles de oxidar:

2 SO₄⁼ ® S₂O₈⁼ + 2 e^-

Por consiguiente, la oxidación del agua se efectúa preferencialmente. La forma de esta reacción puede ser:

H₂O « H⁺ + OH^-

4 OH^- « O_2(G) + 2 H₂O + 4 e^-

Multiplicando la primera ecuación por 4 y sumando la ecuaciones, obtenemos el cambio neto:

2 H₂O ® O_2(G) + 4 H⁺ + 4 e^-

En el ánodo se observa el desplazamiento del oxígeno gaseoso y la solución que rodea al polo se vuelve ácida. En general, el agua se oxida en el ánodo (produciendo oxigeno gaseoso e iones de hidrogeno) mientras que el anión del soluto es difícil de oxidar.

La reacción completa para la electrólisis del Na₂SO₄ acuoso se puede obtener sumando las reacciones del ánodo y del cátodo:

Si se mezcla la solución, los iones hidrogeno e hidróxido producidos se neutralizan entre si y el cambio neta.

2 H₂O -^{electrólisis}- ® 2 H_2(G) + O_2(G)

es meramente la electrólisis del agua. En el transcurso de la electrólisis, el ion hidrogeno se aleja del ánodo, de donde se produce, hacia el cátodo. En forma similar,los iones hidróxido se mueven hacia el ánodo. Estos iones se neutralizan entre si en la solución entre los dos electrodos.

La electrólisis de una solución acuosa de NaCl entre electrodos inertes sirve como un ejemplo de un proceso en el cual se descarga el anión del electrolito, pero el catión no:

Puesto que el ion sodio permanece sin modificación en la solución, la reacción se puede indicar.

2 H₂O + 2 Na⁺ + 2 Cl^- —–^{electrólisis}- ® H_2(G) + Cl_2(G) + 2 Na⁺ + 2 OH^-

Este proceso es una fuente comercial del hidrogeno gaseoso, cloro gaseoso y, por evaporación de la solución restante de la electrólisis, hidróxido de sodio.

En la electrólisis de una solución de CuSO₄ entre electrodos, la corriente es transportada por los iones Cu ²⁺ y SO₄⁼. La corriente que transporta los cationes se descarga, pero los aniones no:

Por supuesto, es posible tener ambos iones del sulfato descargados durante la electrólisis de una solución acuosa. Un ejemplo es la electrólisis del CuCl₂ entre electrodos inertes:

También es posible tener el electrodo mismo dentro de una reacción de electrodo. Si el CuSO₄ se electroliza entre dos electrodos de cobre (figura “3 “), los iones Cu ²⁺ se reducen en el cátodo.

2 e^- + Cu ²⁺ ® Cu

pero de las tres posibles oxidaciones anódicas:

2 SO₄⁼ ® 2 S₂O₄⁼ + 2 e^-

2 H₂O ® O_2(G) + 4 H⁺ + 4 e^-

Cu_(S) ® Cu ²⁺ + 2 e^-

Se observa que ocurre la oxidación del cobre metálico del electrodo. Por esto, en el ánodo, el cobre del electrodo va a la solución como iones Cu ²⁺ y, en el cátodo, los iones Cu ²⁺ se depositan como Cu_(S) sobre el electrodo. Este proceso se usa para refinar cobre. El cobre contaminado se utiliza como el ánodo de una pila electrolítica y la solución de CuSO₄ está electrolizada. El cobre puro se deposita sobre el cátodo. Los electrodos activos también son utilizados en los procesos de electroplateado. En el electroplateado de plata, se utilizan ánodos de plata.

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

APUNTES DE CROMATOGRAFIA

La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los mismos.

 Principios
 La palabra Cromatografía significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente  llamado eluente (fase móvil) a través de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las moléculas que “prefieren disolverse” en la fase móvil serán eluídas más rápido que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separación entre la fase estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o gaseosa

Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la absorción.

El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de  la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.

Clasificación de la Cromatografía

Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos, según su fase móvil se clasifica en  Cromatografía de gases que puede ser a través de dos sistemas, gas- líquido y gas-sólido y Cromatografía líquida donde el eluente es un líquido y puede ser líquido-liquido, liquido-sólido. Por el mecanismo de retención-separación, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografía de reparto, de adsorción y de exclusión. Según la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana. También se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala física y gradientes.

Técnicas cromatográficas

Cromatografía en capa fina.

Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más  utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.
  La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza  por medio de métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
    El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.

Cromatografía en papel.

 El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.

Cromatografía en Columna.

Cromatografía de gases.

Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.

La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separación. La columna  de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón  contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y  ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias,  midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes.  La salida  de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico.

Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).

Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta  o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar  la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su “tiempo de retención” con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

Cromatografía de intercambio iónico.

La Fase Estacionaria  es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

Cromatografía por Permeabilidad en Gel.

Es útil para la separación de proteínas.

 La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.

Cromatografía de Afinidad.

La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

Cromatografía de afinidad

Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.

Fundamento de la cromatografía de afinidad

En la figura  se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.

La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas

  Alta selectividad en el mecanismo de retención

  Campo de aplicación restringido

  Separación de un solo soluto analito

  Empleo de sistema de baja presión

  Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica

Ligandos de afinidad

Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.

Esquema de un cromatograma de afinidad.

Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.

Inmovilización de ligandos

La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas.

El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:

Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que secaracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.

Metodos de elusión

Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.

La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la lectina.

La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.

En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan.

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